Moonlighting Arabidopsis Molybdattransporter 2 Familie und GSH

Kommunikationsbiologie Band 6, Artikelnummer: 801 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Molybdän (Mo) ist ein essentieller Mikronährstoff für Pflanzen und fungiert als aktiver Bestandteil des Molybdän-Cofaktors (Moco). Kernmetabolische Prozesse wie die Nitratassimilation oder die Abscisinsäurebiosynthese basieren auf Moco-abhängigen Enzymen. Obwohl bisher eine Familie von Molybdat-Transportproteinen (MOT1) in Arabidopsis bekannt ist, blieb die Molybdat-Homöostase unklar. Hier berichten wir über eine zweite Familie von Molybdattransportern (MOT2), die eine Schlüsselrolle bei der Verteilung und Verwendung von Molybdat spielen. KO-Phänotypanalysen, zelluläre und organspezifische Lokalisierung und Verbindung zu Moco-Biosynthese-Enzymen über Protein-Protein-Interaktion legen nahe, dass sie am zellulären Import von Molybdat in Blätter und Fortpflanzungsorgane beteiligt sind. Darüber hinaus haben wir einen Glutathion-Molybdat-Komplex entdeckt, der Aufschluss darüber gibt, wie die vakuoläre Speicherung aufrechterhalten wird. Kürzlich wurde für die MOT2-Familie über eine mutmaßliche Golgi-S-Adenosyl-Methionin-Transportfunktion berichtet. Hier schlagen wir eine Schwarzarbeitsfunktion vor, da eindeutige Beweise für den Molybdattransport in einem Hefesystem gefunden wurden. Unsere Charakterisierung der MOT2-Familie und der Nachweis eines Glutathion-Molybdat-Komplexes enthüllen den pflanzenweiten Weg von Molybdat.

Die Moco-Biosynthese ist entscheidend für die Funktionalität von Moco-abhängigen Enzymen (Moco-Enzymen), Schlüsselelementen grundlegender Stoffwechselwege in Pflanzen1. Der vierstufige Prozess umfasst sechs Enzyme und bleibt in allen Lebensbereichen erhalten2. Die Einfügung von Molybdat in Molybdopterin wird durch die Molybdäninsertase Cnx1 (Cofaktor für Nitratreduktase und Xanthindehydrogenase 1) aufrechterhalten, die in einem Multienzymkomplex3 wirkt. Der Moco-Hauptnutzer Nitratreduktase (NR) katalysiert den ersten Schritt der Nitratassimilation4. Moco-Enzyme sind unter anderem an der Biosynthese von Abscisinsäure (ABA) durch die Abscisinaldehyd-Oxidase (AAO)5 und der Sulfit-Entgiftung durch die Sulfit-Oxidase6 beteiligt.

Die effiziente Absorption von Molybdat (MoO42-) und die Verteilung vom Boden in die Zellen ist für die Moco-Biosynthese in Pflanzen von wesentlicher Bedeutung und wird durch spezialisierte Molybdattransporterproteine (MOT) aufrechterhalten7. Es wird angenommen, dass es zwei unabhängige MOT-Familien gibt8,9, jedoch wurden bisher nur Mitglieder der MOT1-Familie charakterisiert, die unterschiedliche physiologische Rollen in der Moco-Biosynthese spielen7.

MOT1.1 (früher bekannt als MOT17; AT2G25680) ist ein Plasmamembranprotein (PM) mit einer hochaffinen Molybdattransportaktivität (Km von 20 nM)10 und wird vor allem in Wurzeln produziert11. Daher fungiert MOT1.1 als radikulärer Molybdat-Importeur aus dem Boden, ist jedoch nicht am Import von Blattzellen oder an der Molybdat-Abgabe an den Moco-Biosynthese-Komplex beteiligt7. Das stark verwandte, tonoplastenlokalisierte MOT1.2 (früher bekannt als MOT27; AT1G80310)12 ist das zweite Mitglied der MOT1-Familie. Es steuert die Freisetzung von gespeichertem Molybdat aus der Vakuole durch direkte Interaktion mit Cnx17.

Trotz der berichteten Funktionen von Mitgliedern der MOT1-Familie blieben zwei Mechanismen unklar, um die Molybdat-Homöostase in Pflanzen vollständig zu verstehen: (i) wie Molybdat in Blatt- und Samenzellen gelangt und (ii) wie es in die Vakuole importiert wird. Es ist denkbar, dass Mitglieder der zweiten MOT-Familie diese Aufgaben übernehmen.

Die unabhängige und nicht verwandte MOT2-Familie wurde erstmals in Chlamydomonas reinhardtii8 entdeckt. CrMOT2 zeigte eine hochaffine Molybdataufnahmeaktivität (Km von 550 nM), wenn es heterolog in Hefe produziert wurde. Orthologe von Genen sind in den meisten Eukaryoten vorhanden, einschließlich Tieren8 und höheren Pflanzen wie Oryza sativa13. Obwohl das Vorhandensein von drei Mitgliedern der MOT2-Familie in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) postuliert wurde8,9, konnte eine MOT-Funktion für diese Familie bisher nicht nachgewiesen werden9,14.

Kürzlich wurde die MOT2-Familie von Arabidopsis mit einer zusätzlichen mutmaßlichen Golgi-Importfunktion von S-Adenosylmethionin (SAM) für die Polysaccharidmethylierung in Verbindung gebracht, die für die korrekte Zellwandbiosynthese notwendig ist .

Hier berichten wir über die Identifizierung von vier Mitgliedern der MOT2-Familie in A. thaliana und zeigen ihre Molybdat-Transportaktivität. PM-Lokalisierung und Interaktion mit der Molybdän-Insertase Cnx1 offenbaren ihre Rolle als Molybdat-Importeure. Aufgrund der zusätzlichen Funktion als Golgi-SAM-Importeure gehen wir von einem Nebencharakter aus. Unsere Erkenntnisse zur globalen Expression eines Mitglieds der MOT2-Familie und seiner Bedeutung für Moco-Hauptnutzer-NR zeigen seine zentrale Rolle bei der Molybdatverteilung und dem zellulären Import zur direkten Bereitstellung der Moco-Biosynthese. Die übrigen Mitglieder der MOT2-Familie werden in Blüten produziert und es wird vermutet, dass sie bei der Samen- und Pollenreifung eine Rolle spielen. Wir haben einen Glutathion-Molybdat-Komplex entdeckt, der zeigt, wie die vakuoläre Speicherung von Molybdat funktioniert. Insgesamt skizzieren unsere Ergebnisse den pflanzenweiten Weg von Molybdat von der Aufnahme, Verteilung, Lagerung und Verwendung in der Moco-Biosynthese.

In Chlamydomonas reinhardtii kommen zwei MOT-Familien vor, die jeweils aus einem Mitglied bestehen: CrMOT115 und CrMOT28. Aufgrund seiner Homologie zu CrMOT2 wurde das Protein AtMOT2.1 von A. thaliana, kodiert durch das Gen AT4G277208, identifiziert. Die kodierten Proteine CrMOT2 und AtMOT2.1 weisen eine Aminosäureähnlichkeit (aa) von 71 % auf und enthalten vier hochkonservierte Motive8, die für MOT2-Proteine charakteristisch sind (Abb. 1a). In einer phylogenetischen Analyse identifizierten Huang et al.9 zwei weitere mot2-verwandte Gene in A. thaliana: Atmot2.2 (AT1G64650) und Atmot2.3 (AT3G49310). Analysen der kodierten Proteine ergaben eine Sequenzähnlichkeit von über 83 % auf AA-Ebene, zeigten ihre Assoziation mit der Haupt-Facilitator-Superfamilie und identifizierten vor allem vier MOT2-spezifische Motive (Abb. 1a). mot2.2 kodiert für zwei Proteine: MOT2.2 A besteht aus 462 aa und seine Spleißvariante MOT2.2B, der die ersten 41 aa fehlen. MOT2.3 besteht aus 460 AA.

ein ClustalW-Alignment von MOT2-Sequenzen aus Chlamydomonas reinhardtii (Cr) und A. thaliana (At). Identische AA sind in Dunkelgrau markiert, ähnliche in Hellgrau und unterschiedliche in Weiß. Vier hochkonservierte Domänen sind mit roten Kästchen markiert. b Repräsentative Wachstumskurve von Moco-Hefen in Molybdat-Chlorat-Medium mit induzierter (schwarz; +Gal) und nicht induzierter (grau; –Gal) mot1.1-Expression. Der Biomasseindex von 40 RLU ist mit einer roten gepunkteten Linie markiert. c Zeit in Stunden, um einen Biomasseindex von 40 RLU von Moco-Hefen mit induzierter (schwarz; +Gal) und nicht induzierter (weiß, –Gal) mot-Expression zu erreichen. Der Mittelwert zweier unabhängiger Experimente wird aufgetragen und Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Zur Prüfung der Signifikanz wurde der ungepaarte T-Test verwendet. **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001. d Rangfolge entsprechend der Zeit bis zum Erreichen eines Biomasseindex von 40 RLU von Moco-Hefen mit induzierter Mot-Expression wie angegeben. Das Wachstumsverhalten wurde auf chloratfreie Kontrollen normalisiert. Die quantitativen Daten in Abb. 1c wurden zusätzlich durch Zwei-Wege-ANOVA und Sidak-Post-hoc-Test zum Mehrfachvergleich analysiert (Tabelle S2).

Die Molybdattransportfunktion der MOT2-Familie wurde durch einen in vivo-Wachstumstest auf Hefebasis getestet. Dem Wildtyp (WT) Saccharomyces cerevisiae fehlen Gene, die mit dem Molybdänstoffwechsel in Verbindung stehen, einschließlich MOTs16. Pilzgene, die für die Moco-Biosynthese und NR aus Neurospora crassa kodieren, wurden nach dem Ansatz von Perli et al.17 in das Hefegenom integriert (Tabelle S1), und bei der Koexpression wurden sowohl Moco-Biosynthese als auch NR-Aktivität nachgewiesen von mot-Kandidatengenen wurde in Wachstumsmedien induziert, die eine physiologische Menge von 100 nM Molybdat enthielten.

Als nächster Schritt wurde ein in vivo-Wachstumstest mit den Moco-Hefestämmen durchgeführt. NR reduziert nicht nur Nitrat zu Nitrit, sondern auch Chlorat zu zytotoxischem Chlorit18,19. Wenn koexprimierte Mot-Kandidaten zum aktiven Molybdattransport fähig sind, werden Moco-Hefen aufgrund der funktionellen Moco-Biosynthese empfindlicher gegenüber Chlorat, was zu aktivem NR führt, das zytotoxisches Chlorit produzieren kann. Die daraus resultierende Wachstumshemmung kann mit einem BioLector®-Wachstumsanalysator quantifiziert werden.

Moco-Hefen, die mot1.1 als Positivkontrolle exprimierten (Abb. 1b), zeigten in Gegenwart von Chlorat und Molybdat ein signifikant beeinträchtigtes Wachstum, wenn die Genexpression durch Galactose induziert wurde. Analysen von mot1.2 und allen mot2-Kandidaten (Abb. 1c) ergaben eine signifikante Wachstumshemmung nach Galaktose-Induktion, vergleichbar mit der Positivkontrolle. Somit verursachte die induzierte Expression aller getesteten mot2-Kandidaten eine vom Molybdattransport abhängige Wachstumshemmung, die auf der Produktion von zytotoxischem Chlorit aufgrund einer erhöhten NR-Aktivität beruhte. Darüber hinaus wurde eine scheinbare Reihenfolge der Molybdat-Transportkapazität beobachtet (Abb. 1d). MOT1.1 und MOT1.2 zeigten die höchste Kapazität, gefolgt von MOT2.3, MOT2.2B, MOT2.2 A und MOT2.1.

Die intrazelluläre Lokalisierung von MOT2 wurde durch Fluoreszenzmikroskopie in Mesophyll-Protoplasten von Nicotiana Benthamiana (N. Benthamiana) aufgeklärt. Alle N-terminal fusionierten Venus-MOT2-Konstrukte zeigten keine oder nur schwache Signale. Folglich wurden nur C-terminal fusionierte MOT2-Venus-Konstrukte analysiert. Alle Mitglieder der MOT2-Familie lokalisierten sich ähnlich als dünne Schicht, die den Protoplasten an seiner Peripherie umgab (Abb. 2). Die Koexpression mit dem Zytosolmarker eqFP611 (Abb. 2a1 – d1) zeigte eine klare Differenzierung der Signale, wohingegen eine Kolokalisierung mit dem PM-Marker AtPIP2A20 (Abb. 2a2 – d2) beobachtet wurde, was auf eine PM-Lokalisierung von MOT2 hinweist. Darüber hinaus wurde Fluoreszenz in vesikelartigen Strukturen nachgewiesen. Ein zusätzliches Lokalisierungsexperiment in A. thaliana-Sämlingen bestätigte die PM-Lokalisierung und zeigte eine Co-Lokalisierung mit dem cis-Golgi-Marker GmMan-121 (Abb. S2).

a–d Vorübergehende chemische Transformation von N. benthamiana-Mesophyll-Protoplasten mit MOT2-Venus-Fusionskonstrukten und Koexpression von eqFP611 als zytosolischem Marker (a1–d1) oder AtTPIP2A-RFP als PM-Marker (a2–d2). Die Bilder sind eine Zusammenführung der Detektionskanäle Venus (gelb), Chloroplasten-Autofluoreszenz (rot) und Marker (eqFP611 in Blau, a1–d1; AtPIP2A-RFP in Cyan, a2–d2). Ein geteiltes Bild, das jeden Fluoreszenzkanal einzeln zeigt, ist in Abb. S1 zu finden. e–l Split-10 + 1 GFP-Topologiestudien durch Agrobacterium-vermittelte transiente Transformation von N. benthamiana-Blättern mit GFP11-MOT2 (e, g, i und k) und MOT2-GFP11 (f, h, j und l). Co-Transformation nach 2 Tagen mit zytosolischem GFP-10 (e1-l1) oder apoplastischem SP-GFP1-10 (e2-l2). Die Bilder sind Zusammenführungen von GFP- (grün) und Chloroplasten-Autofluoreszenz-Detektionskanälen (rot). Die Bilder wurden nach 2–3 Tagen mit einem C-Apochromat 40x/1,2 Wasserimmersionsobjektiv (a–d) oder einem Plan-Neofluar 10x/0,3 Objektiv (e–l) aufgenommen. Maßstabsbalken zeigen 20 μm.

Topologiestudien wurden durchgeführt, um die Ausrichtung des N- und C-Terminus mithilfe eines Split-GFP-Systems in Blattepidermiszellen von N. benthamiana zu bestimmen22. MOT2-Proteine wurden N- (Abb. 2e1 + 2, 2g1 + 2, 2i1 + 2 und 2k1 + 2) oder C-terminal (Abb. 2f1 + 2, 2h1 + 2, 2j1 + 2 und 2l1 + 2) mit dem markiert 11. β-Faltblatt von GFP (GFP11) und wurden entweder mit einem zytosolischen GFP1-10 oder mit GFP1-10, das mit einem Apoplasten-Signalpeptid (SP-GFP1-10) markiert war, koexprimiert. Alle Mitglieder der MOT2-Familie, die N-terminal mit GFP11 (GFP-11-MOT2) markiert waren, zeigten nach Reporterrekonstitution mit dem apoplastischen SP-GFP1-10 ein Fluoreszenzsignal (Abb. 2e2, g2, i2 und k2). Fluoreszenz wurde auch nachgewiesen, nachdem alle C-terminal GFP-11-markierten Mitglieder der MOT2-Familie (MOT2-GFP11) mit zytosolischem GFP1-10 interagierten (Abb. 2f1, h1, j1 und l1). Folglich ist der N-Terminus aller MOT2-Proteine in den Apoplasten orientiert, während der C-Terminus in das Zytosol orientiert ist, was ihre PM-Lokalisierung weiter unterstreicht.

Um den Mitgliedern der MOT2-Familie eine physiologische Rolle zuzuordnen, wurden ihre räumlichen und zeitlichen organspezifischen Expressionsmuster untersucht. Die histochemische Analyse von mot2.1:gus-Pflanzen (Abb. 3a – e) zeigte Signale in Wurzeln, die im Gefäßgewebe konzentriert sind. Die Expression wurde auch in der Epidermis und im Gefäßgewebe von Trieben sowie in sich entwickelnden Blüten mit starken Signalen in den Eierstöcken nachgewiesen. Junge Blätter zeigten eine globale Expression, die mit zunehmendem Alter auf die Hauptblattader reduziert war (Abb. 3b, c), was auch durch fluorimetrische Tests quantifiziert wurde (Abb. 3f). Interessanterweise zeigte der fluorimetrische Test auch einen signifikanten Anstieg der mot2.1-Expression unter Molybdathäufigkeit in allen Organen außer der Blüte. mot2.2:gus-Pflanzen zeigten sehr deutliche Signale in Pollenkörnern reifer Blüten (Abb. 3g). Die Analyse von mot2.3:gus zeigte Signale in den Eierstöcken (Abb. 3h). Die Verfügbarkeit von Molybdat hatte keinen Einfluss auf die Expressionsmuster von mot2.2:gus und mot2.3:gus. Die Expression von mot2.2 und mot2.3 in der Blüte ermöglichte keine fluorimetrische Analyse.

a–e Histochemischer GUS-Assay von mot2.1:gus Arabidopsis-Pflanzen. Dargestellt sind Wurzel (a), altes Blatt (b), junges Blatt (c), Sprossquerschnitt (d) und Fruchtknoten (e). f Fluorimetrischer GUS-Assay von mot2.1.gus-Pflanzen. Aufgetragen ist der Mittelwert von 7–10 Pflanzen aus drei unabhängigen Linien für beide Bedingungen. Jedes Organ wurde als technisches Dreifachexemplar analysiert. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Zur Prüfung der Signifikanz wurde der ungepaarte T-Test verwendet. ns = nicht signifikant, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. g Histochemischer Test der mot2.2:gus-Blume. h Histochemischer Test der mot2.3:gus-Blume. WT zeigt keine Hintergrundaktivität (Abb. S3). Die Bilder 3a, b, c, e, g und h sind identisch mit den jeweiligen Bildern in der ergänzenden Abbildung S3. Die Maßstabsbalken zeigen 500–2000 µm, wie für jedes Panel angegeben. Pflanzen für histochemische Tests wurden hydroponisch unter +Mo-Bedingungen und für fluorimetrische Tests unter +Mo- und -Mo-Bedingungen gezüchtet. Quantitative Daten in f wurden zusätzlich durch Zwei-Wege-ANOVA und Sidak-Post-hoc-Test zum Mehrfachvergleich analysiert (Tabelle S3).

Der Mangel an Molybdat hat eine deutliche Auswirkung auf Pflanzen und führt zu einer verringerten Aktivität von Moco-Enzymen, was zu Wachstumsverzögerungen, Blattnekrose, Zwergwuchs und letztendlich zum Tod führt23. Der Verlust von MOTs kann diesen Phänotyp bei Molybdatmangel verursachen, wie für Mitglieder der MOT1-Familie7 gezeigt wurde. Der Phänotyp der T-DNA-Knockout-Linien (KO) von Arabidopsis mot2 (Tabelle 1) wurde analysiert, um herauszufinden, ob der Verlust von Mitgliedern der MOT2-Familie das vegetative Wachstum und die Molybdathomöostase beeinflusst. Das Zusammenspiel zwischen Mitgliedern der MOT1- und der MOT2-Familie bei der Aufrechterhaltung der Molybdat-Homöostase wurde analysiert, indem KO-Linien mit einem höheren Grad im Vergleich zu WT und einem mot1.1-Einzel-KO charakterisiert wurden, der den Hauptwurzel-Molybdat-Importeur MOT1.1 kodiert. hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf das vegetative Wachstum. Ein Verlust des vakuolären Exporters MOT1.2 zeigte keine Auswirkungen, weder auf den makroskopischen noch auf den molekularen Phänotyp, wie in einer aktuellen Studie7 beobachtet wurde. Aufgrund der organspezifischen Expressionsmuster von mot2.2 und mot2.3 (Abb. 3g, h; Abb. S3) wurden beide von KO-Analysen höheren Grades ausgeschlossen.

Interessanterweise wurden keine nennenswerten Veränderungen im Überleben, in der Entwicklung (Abb. S4) oder im Wachstumsverhalten der Pflanzen beobachtet (Abb. 4a – c). Da MOT2.1 hauptsächlich im Wurzelgefäßgewebe vorhanden ist (Abb. 3a), wurde ein Molybdataufnahmetest durchgeführt, um zu testen, ob die Aufnahme in mot2.1-KO-Pflanzen beeinträchtigt ist (Abb. 4d). Während die Molybdataufnahmerate der Positivkontrolle mot1.1-KO im Vergleich zur WT signifikant verringert war, zeigte mot2.1-KO nur eine geringfügige Verringerung. Die NR-Aktivität steht in direktem Zusammenhang mit der Moco-Verfügbarkeit und ist daher ein wichtiger Indikator für die Funktionalität der Molybdatversorgung. Molybdatmangel reduzierte die NR-Aktivität im WT (Abb. 4e) signifikant von 0,47 nmol ∙ (h ∙ mgFW)−1 um 32 % auf 0,32 nmol ∙ (h ∙ mgFW)−1. Vergleichbare Ergebnisse wurden für mot2.2-KO und mot2.3-KO beobachtet. Interessanterweise zeigte mot2.1-KO sowohl unter Molybdatverfügbarkeits- als auch unter Molybdatmangelbedingungen eine signifikante Reduzierung der NR-Aktivität um 30 %.

Arabidopsis mot2-KOs wurden 85 Tage lang unter Molybdatverfügbarkeit (+/+Mo) und -entzug (–/–Mo) in einem Hydrokultursystem gezüchtet. ein frisches Gewicht Rosettenblätter. b Wurzellänge. c Wachstumskurve der Blattfläche innerhalb von 85 Tagen. Aufgetragen ist der Mittelwert von 8–15 Personen. d Molybdataufnahmerate normalisiert auf die Blattfläche von WT, mot1.1-KO und mot2.1-KO von 56 Tage alten Pflanzen. Aufgetragen ist der Mittelwert von 6–9 Individuen für die Kontrollen und 26 Individuen des mot2.1-KO. Quantitative Daten wurden zusätzlich durch Einweg-ANOVA und Dunnet-Post-hoc-Test zum Mehrfachvergleich analysiert (Tabelle S4). e NR-Aktivität von mot2-KOs, die 60 Tage lang hydroponisch gezüchtet wurden. Aufgetragen ist der Mittelwert von 8–15 Personen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Für Signifikanztests wurde der ungepaarte T-Test verwendet. ns = nicht signifikant, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Quantitative Daten wurden zusätzlich durch Zwei-Wege-ANOVA und Tukey-Post-hoc-Test zum Mehrfachvergleich analysiert (Tabelle S5).

Der mot1.1 mot2.1 Doppel-KO (dKO) und ein mot1.1 mot1.2 mot2.1 Dreifach-KO (tKO) zeigten beim hydroponischen Anbau unter Molybdatmangel nur geringfügige Veränderungen im Frischgewicht, der Blattflächenproduktion und der Wurzellänge (Abb . S5a–c) im Vergleich zur Molybdatverfügbarkeit. Unter den gleichen Bedingungen zeigte mot1.1 eine deutliche Verringerung der Blattflächenproduktion, wie kürzlich beobachtet wurde7. Interessanterweise zeigte das a mot1.1 mot1.2 mot2.1 tKO ein Pflanzenüberleben, das im Vergleich zu Kontrollbedingungen signifikant um 45 % reduziert war (Abb. S5d). Die beobachtete signifikante Verringerung der NR-Aktivität im mot1.1 mot2.1 dKO (Abb. S5e) war vergleichbar mit der des mot1.1 KO unter Molybdatmangel, wie bereits zuvor beschrieben7. Interessanterweise zeigte das mot1.1 mot1.2 mot2.1 tKO selbst unter Bedingungen der Molybdatverfügbarkeit eine drastisch verringerte NR-Aktivität, die unter Molybdatmangel noch deutlich verringert wurde.

Zytosolische Moco-Biosynthese-Proteine unterliegen engen Protein-Protein-Wechselwirkungen in einem Multiproteinkomplex, der durch Cnx124 an Aktin verankert ist. Zusätzlich wird Cnx1 durch Interaktion mit MOT1.27 mit Molybdat aus der Vakuole versorgt. Daher wurde eine direkte Versorgung von Cnx1 mit extrazellulärem Molybdat durch Protein-Protein-Interaktion mit der MOT2-Familie mittels bimolekularer Fluoreszenzkomplementation (BiFC) untersucht.

Hier wurde nur eine C-terminale Reporterfusion mit Mitgliedern der MOT2-Familie berücksichtigt, da Topologiestudien ergaben, dass nur der C-Terminus in das Zytosol orientiert ist. Aquaporin AtPIP2A ist PM-lokalisiert20 und diente als Negativkontrolle. Mit Cnx1-SCYCE koexprimiertes MOT2.1-VYNE zeigte eine hellere Fluoreszenzintensität (Abb. 5a1) als die Negativkontrolle (Abb. 5a2). Abundanzkontrollen (Abb. S6) zeigten vergleichbare Fluoreszenzintensitäten, was darauf hindeutet, dass MOT2.1 und AtPIP2A in gleichen Mengen vorhanden waren. Die Ergebnisse zeigen die Interaktion von MOT2.1 mit Cnx1. Die Analyse von MOT2.1 und Cnx1 durch Split-Luciferase-Experimente (Split-LUC) unterstreicht diese Wechselwirkung und bezeichnet die G-Domäne von Cnx1 als Hauptinteraktionspartner (Abb. S7). BiFC-Interaktionsansätze von MOT2.2A (Abb. 5b1) und MOT2.3 (Abb. 5d1) zeigten höhere Fluoreszenzintensitäten im Vergleich zu den jeweiligen Negativkontrollen, die Wechselwirkungen mit Cnx1 zeigten (Abb. 5b2, d2). Lediglich der kürzere MOT2.2B zeigte keine Interaktion mit Cnx1 (vergleiche Abb. 5c1, c2).

a1–d1 Interaktionsansätze mit vorübergehend transformierten Blättern von N. benthamiana, die MOT2-VYNE und Cnx1-SCYCE koexprimieren. a2–d2 Negativkontrollen mit AtPIP2A-VYNE. Die Bilder zeigen die Zellschicht der unteren Blattepidermis und wurden mit einem Plan-Neofluar 10x/0,3 aufgenommen. Maßstabsbalken zeigen 20 μm. Abundanzkontrollen, bei denen CLuc Cnx1 ersetzt, zeigten vergleichbare Fluoreszenzintensitäten der interessierenden Proteine und die Negativkontrolle zeigte Artefakte, die aus zufälligen Wechselwirkungen stammten (Abb. S6).

Bisher war unklar, wie Molybdat in die Vakuole importiert wird. Da kein Mitglied der MOT2-Familie im Tonoplasten lokalisiert war, wird ein unabhängiger Mechanismus vermutet. Daher vermuteten wir eine komplexe Bildung von Glutathion (GSH) und dem Schwermetallion (HM) Molybdat. Im Allgemeinen werden HMs (z. B. Cadmium) durch GSH unspezifisch sequestriert, in die Vakuole geleitet und freigesetzt25.

Die Komplexbildung von GSH mit Cadmiumionen induziert einen Ladungstransfer von Sulfhydrylgruppen, der eine Absorption im fernen ultravioletten (UV) Spektralbereich zeigt26. Um zu untersuchen, ob ein solcher Effekt für die Molybdat-Sequestrierung verantwortlich sein könnte, wurden äquimolare Konzentrationen von GSH und Molybdat gemeinsam inkubiert und spektroskopisch analysiert (Abb. 6a). Nach Abzug des Molybdat-Hintergrunds wurde eine Bathochromverschiebung von λmax = 221 nm zu λmax = 261 nm und eine erhöhte Peakintensität beobachtet, wenn beide Komponenten gemischt wurden, was einen ersten Hinweis auf GSH-Molybdat-Komplexe gibt.

a UV-Spektren von GSH und GSH mit Molybdat. b HRMS-Spektren von GSH, Molybdat und einer GSH-Molybdat-Mischung, aufgenommen im Negativmodus. Dargestellt sind absolute Ionenintensitäten im Bereich von m/z = 420–445. In der GSH-Probe sind keine dominanten Ionen vorhanden. Nicht zugeordnete Ionen im Molybdat-MS stammen möglicherweise von Polymolybdaten. Die Lösung, die sowohl Molybdat als auch GSH enthält, zeigt neue Ionen, die in den Stammlösungen, die nur GSH oder Molybdat enthalten, nicht vorhanden sind. Vergleich mit dem berechneten Isotopenmuster einer GSH-Molybdat-Komplexsummenformel C10H14MoN3O8S-. c MS2-Fragmentierung von C10H14MoN3O8S- mit 25 normalisierter Kollisionsenergie. Die experimentell beobachteten Fragmentmassen stimmten mit den berechneten überein (Panel d). d Vorgeschlagene Fragmentierung eines Molybdat-Chelatkomplexes mit zweizähnigem GSH, passend zu den in MS2-Experimenten beobachteten Ionen (Panel c). Aufgeführt sind exakte Massen und entsprechende Summenformeln.

Das Vorhandensein von GSH-Molybdat-Komplexen wurde durch hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) nachgewiesen. Gemischte Lösungen von GSH und Molybdat zeigen ein Ion, das in reinen Lösungen beider Komponenten nicht vorhanden ist. Dem neuen Ion ([M-H+] = 433,9561) wurde die Summenformel C10H14MoN3O8S- zugewiesen (Abb. 6b), was auf die Bildung eines Chelatkomplexes mit zweizähnigem GSH und Molybdat unter Wasserabspaltung hinweist. Dieser Komplex bildete sich reproduzierbar unter verschiedenen Molverhältnissen von GSH und Molybdat (1:1 bis 9:1) und verschiedenen pH-Werten (pH = 3–9). Das beobachtete Isotopenmuster stimmt mit dem berechneten Isotopenverhältnis für einen GSH-Molybdat-Komplex überein (Abb. 6b). Der zweizähnige Charakter von GSH ermöglicht mehrere Arten der Molybdatkomplexierung. Daher wurde das entsprechende Ion (m/z = 433,9561) mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS2) bei verschiedenen Kollisionsenergien analysiert, um seine Struktur zu entschlüsseln (Abb. 6c). Die Verwendung von isotopenangereichertem (98MoO42-) vereinfachte die MS2-Spektren, die den Verlust eines Fragments zeigten, das mit C5H7NO3 übereinstimmt. Dieses Fragment wurde Glutamin zugeordnet (Abb. 6d), was darauf hinweist, dass Molybdat durch Glycin und Cystein komplexiert ist. Dementsprechend unterstützte ein HMoO3S- entsprechendes Fragment die Komplexierung von Cystein durch Schwefel (Abb. 6c, d). Diese HRMS-Experimente legen nahe, dass GSH als zweizähniger Ligand fungiert und Molybdat über das Carboxylat von Glycin und das Thiol in Cystein chelatisiert.

Molybdat ist ein wichtiger Mikronährstoff für Pflanzen und fungiert als aktiver Bestandteil von Moco, auf dem die Aktivität wichtiger Moco-Enzyme beruht. Die Molybdataufnahme wird durch spezielle MOT-Proteine aufrechterhalten. Während die Physiologie der MOT1-Familie bei Arabidopsis gut verstanden ist7, blieb die globale Molybdathomöostase bisher unklar. Das Vorhandensein einer MOT2-Familie in A. thaliana wurde wiederholt postuliert, ihre MOT-Funktion konnte jedoch bisher nie experimentell nachgewiesen werden. Durch In-silico-Studien wurden drei mot2-Gene identifiziert, die vier MOT2-Proteine mit hoher Sequenzähnlichkeit zum charakterisierten CrMOT2 kodieren8,9. Alle kodierten Proteine haben vier hochkonservierte Motive gemeinsam, die für den Molybdattransport essentiell sind8. Alle vier MOT-Kandidaten importierten Molybdat in Hefezellen mit geringerer Kapazität als MOT1.1, das als Importeur mit hoher Affinität charakterisiert wurde10. Darüber hinaus sind alle MOT2 im PM lokalisiert. Daher behalten Mitglieder der MOT2-Familie im Allgemeinen den Molybdat-Import aus dem extrazellulären Raum in das Zytosol bei. Ihr individuelles organspezifisches Expressionsmuster lässt jedoch auf vielseitige physiologische Funktionen schließen, die die MOT1-Familie ergänzen.

Kürzlich wurde gezeigt, dass der Verlust des wichtigsten radikulären Molybdat-Importeurs MOT1.1 zu Zwergwuchs und einer drastisch verringerten NR-Aktivität bei Molybdat-Mangel aufgrund einer verringerten Molybdat-Aufnahme führte7. Die beobachtete Expression von mot2.1 in Wurzeln könnte auf eine unterstützende Rolle bei der Molybdataufnahme hinweisen. Der Verlust von MOT2.1 hat jedoch keinen Einfluss auf die Molybdataufnahme aus dem Boden, was auf eine andere Funktion nach der Aufnahme von Molybdat durch MOT1.1 hinweist. MOT2.1 könnte vielmehr für die Molybdatverteilung innerhalb der Pflanze sowie die Bereitstellung von Molybdat für die Moco-Biosynthese verantwortlich sein. Dieses Modell wird durch eine starke Expression von mot2.1 im jungen Blattgewebe, im Gefäßgewebe der Triebe und in der Hauptblattvene gestützt, die durch das Vorhandensein von Molybdat, seine PM-Lokalisierung und seine direkte Proteininteraktion mit der Molybdän-Insertase Cnx1 induziert wird. Der Verlust von MOT2.1 beeinträchtigte die Effizienz der Moco-Biosynthese aufgrund einer verringerten Molybdatversorgung, beobachtet durch eine Verringerung der NR-Aktivität. Im Gegensatz dazu hatte das Fehlen von MOT2.2 A, MOT2.2B und MOT2.3 weder einen Einfluss auf das vegetative Wachstum noch auf die NR-Aktivität. Dies lässt den Schluss zu, dass, obwohl eine Interaktion von MOT2.2 A und MOT2.3 mit Cnx1 nachgewiesen wurde, sie bei der Moco-Biosyntheseversorgung nur eine untergeordnete Rolle spielen.

Bemerkenswert ist, dass alle Mitglieder der MOT2-Familie in der Blüte zum Ausdruck kommen. Sowohl mot2.1 als auch mot2.3 werden in den Eierstöcken stark exprimiert, wo der Import essentieller Nährstoffe in die sich entwickelnden Samen stattfindet. Unter Berücksichtigung ihrer organspezifischen Expression kann man davon ausgehen, dass sie an der Beladung von Molybdat in sich entwickelnden Samen beteiligt sind.

Zusätzlich zur Bereitstellung von Molybdat für die Tochtergeneration könnten hohe Molybdatmengen in sich entwickelnden Samen zwei weitere Aufgaben erfüllen. Erstens katalysiert das Moco-Enzym AAO den letzten Schritt der ABA-Biosynthese, das Schlüsselhormon zur Förderung der Samenruhe5. Obwohl der Großteil der ABA aus vegetativem Gewebe stammt und zum Samen transportiert wird, wird ABA auch im Samenhüllengewebe produziert27. Dieser Bedarf an Molybdat für funktionelles Moco kann durch MOT-Aktivität gedeckt werden. Zweitens könnten hohe Molybdatkonzentrationen (>250 µM) in den Fortpflanzungsorganen im Hinblick auf ihre hemmende Wirkung auf Purpursäurephosphatasen (PAP)28 erforderlich sein. Die Hauptspeicherform von Phosphor in Samen und Pollenkörnern ist Phytinsäure. Ein Mitglied der PAPs, AtPAP15, ist in Pollenkörnern lokalisiert und gilt als Schlüsselphytase während der Pollenkeimung zur Mobilisierung von Phosphorreserven28. Eine genomweite Analyse der pap-Gene in Brassica rapa ergab mögliche Funktionen mehrerer PAPs bei der Reifung, Keimung und Verlängerung des Pollenschlauchs29. Daher kann davon ausgegangen werden, dass Molybdat als Schlüsselinhibitor auf PAPs wirkt, um eine vorzeitige Pollenreifung und -keimung zu verhindern. Die Expression von mot2.2 in Pollenkörnern lässt auf eine Beteiligung an diesem wichtigen Prozess schließen.

Die Aufklärung der physiologischen Rollen der MOT2-Familie gibt einen umfassenden Einblick in die Molybdathomöostase. Der radikuläre Importeur MOT1.1 absorbiert Molybdat aus dem Boden mit einer auffallend hohen Affinität7,10. In jüngeren Pflanzen ist MOT2.1 über die direkte Interaktion mit Cnx1 an der pflanzenweiten Verteilung, dem zellulären Import und der Versorgung der Moco-Biosynthese mit Molybdat beteiligt. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Vakuole als Hauptspeicher dient12, von wo Molybdat durch MOT1.2 exportiert und an Cnx1 für die Moco-Biosynthese7 übergeben wird. Interessanterweise hat eine Störung dieses Zusammenspiels schwerwiegende Auswirkungen auf das vegetative Wachstum. Der gleichzeitige Verlust des wichtigsten radikulären Importeurs MOT1.1, des wichtigsten zellulären Importeurs MOT2.1 und des Tonoplasten-Exporteurs MOT1.2 zeigte eine drastische Verringerung der NR-Aktivität, die in einer stark verringerten Pflanzenüberlebensrate unabhängig von der Anwesenheit von Molybdat gipfelte.

Da freies Molybdat als HM-Ion ein gefährliches Potenzial aufweist25, wirft der Weg von Molybdat durch die Pflanze eine interessante Frage auf: Wie wird Molybdat nach dem Zellimport in die Vakuole importiert? Ein allgemeiner Bewältigungsmechanismus ist die durch GSH-S-Transferasen vermittelte Konjugation von HM-Ionen mit GSH30. Das Konjugat wird in die Vakuole importiert und dissoziiert aufgrund von pH-Verschiebungen25. Daher nehmen wir an, dass überschüssiges Molybdat durch GSH gebunden wird, um toxische Prozesse zu vermeiden. Dieses Modell wurde durch eine Bathochrom-Verschiebung der Absorption gestützt, die durch die Bildung von GSH/Molybdat-Komplexen verursacht wurde, wie für mehrere HM/GSH-Komplexe26,31 gezeigt und zusätzlich durch Massenspektrometrieexperimente belegt wurde. Diese Ergebnisse stützen ein Modell, bei dem Molybdat in Konjugation mit GSH durch unspezifische HM/GSH-Transporter in die Vakuole geschleust wird32. Dort dissoziierte der Komplex aufgrund der pH-Verschiebung, so dass Molybdat gespeichert und von MOT1.2 exportiert werden kann, wenn es für die Moco-Biosynthese benötigt wird. Alle Mitglieder der MOT2-Familie werden in den Fortpflanzungsorganen exprimiert, um Molybdat zu importieren. Beide Spleißvarianten von MOT2.2 könnten dabei unterschiedliche Rollen erfüllen: Während MOT2.2 A direkt mit der Moco-Biosynthese interagiert, um AAO bereitzustellen, interagiert MOT2.2B nicht mit der Moco-Biosynthese und könnte freies Molybdat für die PAP-Hemmung und das Saatgut liefern Nahrungsspeicherung.

Kürzlich wurden Proteine der MOT2-Familie als SAM-Transporter im Golgi14 involviert. In dieser Studie zeigte der doppelte KO von mot2.1 (GoSAMT2) und mot2.2 (GoSAMT1) eine verringerte Golgi-synthetisierte Polysaccharidmethylierung und eine veränderte Zellwandarchitektur. Darüber hinaus waren Fluoreszenzsignale von MOT2-GFP gemeinsam mit dem GFP-markierten Golgi-Marker GmMan-1 lokalisiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie bestätigten die Golgi-Lokalisierung aller Proteine der MOT2-Familie, zeigten aber auch deren klare PM-Lokalisierung und, was am wichtigsten ist, Molybdattransportaktivität. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Lokalisierung und unterschiedlichen Substrate kann man davon ausgehen, dass die MOT2-Familie Nebencharakter hat, da sie mehr als nur eine Funktion erfüllt33. Die Aktivität von Proteinen der MOT2-Familie in Golgi und PM ist wahrscheinlich, da der Golgi eine Station von Mitgliedern der MOT2-Familie auf ihrem Weg zu ihrem endgültigen Ziel, dem PM34, ist. Auch für andere Mitglieder des Moco-Metabolismus wurde Nebentätigkeit nachgewiesen35. Beispielsweise ist Gephyrin, das menschliche Homolog von Cnx1, an der Interaktion zwischen neuronalem Transporter und Mikrotubuli beteiligt36, während Moco-Bindungsproteine auch an der Cytokinin-Biosynthese beteiligt sind37. Daher sind die Mondscheintransporter der MOT2-Familie von zentraler Bedeutung für den SAM-Import in Golgi und die pflanzenweite Molybdathomöostase

Die Molybdat-Transportaktivitäten von MOT2-Kandidaten wurden in Hefe getestet. Da die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae im Laufe der Evolution den Molybdänstoffwechsel verloren hat und daher keine Moco-Enzyme enthält16, ist sie ein geeigneter Modellorganismus zum Testen des Molybdattransports, wie in Tabelle S1 ausführlich beschrieben.

N. benthamiana WT-Pflanzen wurden zur Lokalisierung, Topologie und BiFC-Analyse verwendet. Der Ökotyp WT A. thaliana Col-0 wurde zur Erzeugung stabiler transgener Linien, die endogene mot2:gfp-gus-Konstrukte tragen, und als Kontrollpflanzen verwendet. A. thaliana T-DNA-Insertions-KO-Linien (Tabelle 1) wurden von NASC (Nottingham, UK) gepflegt. Das Vorhandensein einer T-DNA-Insertion an den richtigen Loci und der homozygote Status der verwendeten KO-Linien wurden mit Genotypisierungs-PCRs überprüft. KOs höheren Grades wurden durch manuelles Kreuzen einzelner KO-Linien erzeugt. Der Status der Molybdatverfügbarkeit zwischen den von NASC erworbenen Linien und den durch manuelles Kreuzen erzeugten Linien konnte nicht validiert werden.

Atmot2.1 wurde gemäß Tejada-Jiménez8 mithilfe von TAIR38 identifiziert. Die Analyse von mot2.1 mit EnsmblPlants39 ergab zwei stark verwandte Paraloge in A. thaliana (AT1G64650 und AT3G49310). Zur Analyse der Sequenzähnlichkeit wurde ein ClustalW-Alignment der MOT2-Familie mit MEGA1140 durchgeführt. Die Ausrichtung wurde mit der BioEdit-Software41 visualisiert. Die Sequenz von mot2.2b wurde aufgrund der vollständigen Übereinstimmung mit mot2.2a von dieser Analyse ausgeschlossen.

Die Molybdattransportaktivität von MOT2-Kandidaten wurde durch einen In-vivo-Wachstumstest unter Verwendung transgener Moco-Hefestämme untersucht (Tabelle S1). Das Wachstumsmedium pH 5,8 bestand aus Hefe-Stickstoff-Basismedium (6,7 g/L; Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) und wurde mit 10x Dropout-Lösung (200 mg/L Arginin, 300 mg/L Isoleucin, 300 mg/L Lysin) ergänzt. 200 mg/L Methionin, 500 mg/L Phenylalanin, 2000 mg/L Threonin, 300 mg/L Tyrosin, 1500 mg/L Valin, 100 mg/L L-Adenin-Hemisulfat, 200 mg/L Histidin, 1000 mg/L Leucin, 400 mg/L Tryptophan), verdünnt auf 1-fache Konzentration und 0,2 % (w/v) Fructose (Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande). Nach 48-stündigem Schütteln bei 200 U/min und 30 °C wurden 10 ml der mit einem Moco-Hefestamm beimpften Vorkultur zu 190 ml Wachstumsmedium für die Hauptkultur gegeben und analog inkubiert. Anschließend wurde die Hefesuspension in 50-ml-Röhrchen gefüllt und 15 Minuten bei 5200 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 1-ml-Reaktionsröhrchen aufgeteilt, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation bei 5200 × g. Nach dem Ablassen des Überstands wurde das Pellet in flüssigem Stickstoff eingefroren. Galaktose (Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande) wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 % (w/v) zu einem Wachstumsmedium gegeben, das 250 mM Natriumchlorat (NaClO3; Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) und 100 nM Natriummolybdat (Na2MoO4; Sigma) enthielt Aldrich, St. Louis, MI, USA) zur Induktion der mot-Genexpression. Für Nicht-Induktionsbedingungen wurde stattdessen die gleiche Menge Wasser hinzugefügt. Das Wachstumsmedium wurde mit transgenen Moco-Hefestämmen bis zu einer OD600 von 0,1 beimpft. Ein Kontrollansatz enthielt kein Natriumchlorat. Eine MTP-Blütenplatte mit 48 Vertiefungen (m2p labs Beckman Coulter, Aachen, Deutschland) wurde mit 1 ml Zellsuspension pro Vertiefung in Duplikaten beladen und mit semipermeabler Folie (F-GPR48-10, m2p labs Beckman Coulter, Aachen, Deutschland) versiegelt. Deutschland), um den Gasaustausch zu ermöglichen. Die Blütenplatte wurde in einen BioLector® I (m2p labs Beckman Coulter, Aachen, Deutschland) geladen, was eine Inkubation der Platte unter Schütteln bei 1200 U/min für 7 Tage bei 30 °C und gleichzeitige Überwachung des Biomasseanstiegs ermöglichte. Daher wurde die Lichtstreuung bei 620 nm als relative Lichteinheit (RLU)-Ausgabe als Biomasseindex erfasst. Um einen Vergleich verschiedener Stämme zu ermöglichen und das Wachstumsverhalten weiter zu analysieren, wurde ein Biomasseschwellenwert von 40 RLU gewählt. In Kontrollansätzen konnte gezeigt werden, dass der Einfluss einzelner Wachstumstestkomponenten (Natriumchlorat, Natriummolybdat und Zuckerkombinationen) auf das Wachstumsverhalten jedes Moco-Hefestamms vernachlässigbar war.

Die kodierenden Sequenzen (CDS) der A. thaliana-Gene mot2.1 (AT4G27720), mot2.2a (AT1G64650.1), mot2.2b (AT1G64650.2) und mot2.3 (AT3G49310) wurden durch Phusion-Polymerase (Thermo Scientific) amplifiziert , Waltham, MA, USA) aus cDNA von A. thaliana mit attB-stellenflankierten Primern zur Verwendung des GATEWAY-Klonsystems (Invitrogen, Waltham, MA, USA). PCR-Fragmente wurden durch BP-Reaktion in den pDONR/Zeo-Vektor eingefügt, wodurch pEntry-mot2-Eintrittsvektoren erzeugt wurden.

Für Lokalisierungsstudien wurden die resultierenden Eintrittsvektoren mit pDest-GW-Venus-Vektoren unter Verwendung einer LR-Reaktion rekombiniert, um Expressionsvektoren zu erzeugen, die für mot2-Venus-Fusionskonstrukte kodieren. Als zytosolischer Marker wurde eqFP61142 verwendet. Um einen PM-Marker zu erstellen, wurde das CDS von Atpip2a (AT3G53420) aus A. thaliana mit attB-stellenflankierten Primern amplifiziert und durch BP-Reaktion in den pDONR/Zeo-Vektor subkloniert. Die Rekombination mit pDest-GW-rfp43 durch LR-Reaktion führte zum Expressionsvektor pExp-Atpip2a-rfp. Der Golgi-Marker man1 aus Soja (Glycine max) wurde aus zwei Oligonukleotiden synthetisiert, die in einer ersten PCR angelagert und amplifiziert wurden. Eine zweite PCR mit attB-stellenflankierten Primern ermöglichte die Verwendung des Fragments in einer BP-Reaktion zur Erstellung eines Eintrittsvektors. Eine LR-Reaktion mit pDest-GW-rfp erzeugte den Expressionsvektor pExp-GmMan-1-RFP.

Topologiestudien der MOT2-Familie wurden mit dem GATEWAY-basierten Split-10 + 1 GFP-System22 durchgeführt. Die Vektoren wurden freundlicherweise von Prof. Thordal-Christensen von der Universität Kopenhagen zur Verfügung gestellt. Die LR-Reaktion von pEntry-mot2-Vektoren und pDest-GW-gfp11- und pDest-gfp-GW-Expressionsvektoren wurde generiert, die für Konstrukte kodierten, bei denen GFP11 entweder an den N- oder C-Terminus von MOT2 fusioniert war. Das GFP1-10-Fragment wurde entweder mit zytosolischer Lokalisierung (GFP1-10) oder mit Lokalisierung im Apoplasten unter Verwendung des Signalpeptids von AtWAK2 (A. thaliana Wall Associated-Kinase 2, AT1G21270) koexprimiert, was zu SP-GFP1-1044 führte .

Für BiFC-Assays wurden Eintrittsvektoren mit CDS von mot2 und Atpip2a durch LR-Reaktion mit dem Zielvektor pDest-GW-vyne rekombiniert, was zu Expressionsvektoren führte, die für mot2-vyne- und Atpip2a-vyne-Konstrukte kodierten. Als Häufigkeitskontrolle wurde die C-terminale Hälfte der zytosolischen Luciferase (CLuc)24 verwendet. Das CDS wurde durch Phusion-PCR mit attB-stellenflankierten Primern amplifiziert und in einer BP-Reaktion zur Erzeugung von Eintrittsvektoren verwendet. Diese wurden in der LR-Reaktion mit pDest-GW-vyne und pDest-GW-scyce verwendet, um die Expressionsvektoren pExp-Atpip2a-vyne und pExp-nsp3-scyce zu erzeugen. Die Erzeugung von pExp-cnx1-scyce-Expressionsvektoren erfolgte durch LR-Reaktion mit dem pDest-GW-scyce-Zielvektor und dem Eintrittsvektor pEntry-cnx1 (AT5G20990)43.

Für Split-Luc-Analysen generierte LR-Reaktion unter Verwendung von pEntry-mot2.1 und pDest-GW-cluc pExp-mot2.1-cluc-Expressionsvektoren. Die Expressionsvektoren pExp-cnx1-nluc, pExp-cnx1e-nluc, pExp-cnx1g-nluc, die Negativkontrollen pExp-nsp3-nluc und die Häufigkeitskontrolle pExp-scyce-nluc wurden durch Klonierung der Eintrittsvektoren pEntry-cnx1 (AT5G20990) mittels LR-Reaktion erzeugt ), pEntry-nsp3 (AT3G16390) und den BiFC-Terminus pEntry-scyce in den Zielvektor pDest-GW-nluc45. Der Expressionsvektor pExp-Atpip2a-cluc wurde durch LR-Reaktion mit pEntry-Atpip2a und pDest-GW-cluc erzeugt. Die zur Erzeugung der Vektoren (Tabelle S6) dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle S7 aufgeführt. Die Pflanzentransformation für Lokalisierung, Topologie, BiFC und Split-Luc-Assay wurde gemäß Minner-Meinen et al.7 durchgeführt. Die Expression in N. benthamiana-Blättern erfolgte durch eine durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation45,46,47. Die Protoplastenvorbereitung und die chemische Transformation wurden gemäß Negrutiu et al.48 durchgeführt. A. thaliana-Sämlinge wurden mit der FAST-Methode (Fast Agro-Mediated Seedling Transformation) transformiert49.

Die Keimung von N. benthamiana gelang in gewöhnlicher Blumenerde bei 22–25 °C mit 10 Stunden künstlichem Licht (≈ 60 µE) pro Tag unter Gewächshausbedingungen und ausreichender Wasserversorgung. Die Sämlinge wurden zwei Wochen nach der Keimung in 9 × 9 cm große Töpfe überführt, die Topferde mit 1 % NPK-Dünger (Blaukorn® classic, Compo Expert, Münster, Deutschland) und 5 % Perlit enthielten. Für die Versuche wurden fünf bis zwölf Wochen alte Pflanzen verwendet. A. thaliana-Samen wurden 48–72 Stunden lang bei 4 °C geschichtet. Zwei Wochen nach der Keimung auf gewöhnlicher Topferde wurden die Sämlinge in 5 × 5 cm große Töpfe überführt und bei 22–25 °C in einer begehbaren Phytokammer mit 10 Stunden künstlichem Licht (≈ 60 µE) pro Tag und 60–25 °C kultiviert. 70 % Luftfeuchtigkeit.

Die Pflanzen wurden in einem hydroponischen Wachstumssystem50 gezüchtet, das nach Minner-Meinen et al.7 modifiziert wurde. Keimung und Grundnährlösung (¼ Hoagland-Lösung) mit einem pH-Wert von 5,6 wurden entweder mit 100 nM Natriummolybdat (+ Mo, Molybdat-Verfügbarkeit) oder durch Ausschluss von Natriummolybdat aus der Originalrezeptur (-Mo, Molybdat-Entzug) hergestellt. . A. thaliana-Samen wurden auf Deckel von Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Nadelloch ausgesät und in einen Keimtank gegeben. Nach 20 Tagen wurden die Pflanzen in belüftete Tanks überführt und nach einer Gesamtzeitspanne von 60 Tagen geerntet. Aus den Keimtanks wurden die Sämlinge auch in 130-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und unter Bedingungen der Molybdatverfügbarkeit für den Molybdataufnahmetest gezüchtet.

Blütenblätter und Staubblätter einer Blüte der Mutterpflanze, die einen T-DNA-Insertions-KO trug, wurden entfernt, um eine Selbstbefruchtung des Eierstocks zu verhindern. Zur Befruchtung des vorbereiteten Eierstocks der Mutterpflanze wurde ein Staubblatt mit reifem Pollen einer Vaterpflanze mit einem zweiten T-DNA-Insertions-KO verwendet. Der befruchtete Eierstock wurde zur Samenreife gebracht. Die geernteten Samen wurden unter Antibiotika-Selektion gezüchtet und das Vorhandensein der vererbten T-DNA-Insertion wurde mittels Genotypisierungs-PCR getestet.

Endogene Promotoren wurden als die Region von 1998 bp (mot2.1), 1924 bp (mot2.2) und 1980 bp (mot2.3) stromaufwärts jedes Startcodons definiert. Regionen wurden aus genomischer DNA von A. thaliana durch Phusion-PCR mit attB-stellenflankierten Primern amplifiziert. Fragmente wurden unter Verwendung des GATEWAY-Klonsystems (Invitrogen, Waltham, MA, USA) über BP-Reaktion, die Eintrittsvektoren erzeugte, in pDONR/Zeo subkloniert. Durch Rekombination mittels LR-Reaktion mit pKGWFS751 wurden Expressionsvektoren erzeugt, die für ein GFP-GUS-Fusionskonstrukt kodieren, das unter der Kontrolle der endogenen mot2-Promotoren (mot2.1:gus, mot2.2:gus und mot2.3:gus) exprimiert wird. Um stabile A. thaliana-Linien zu erzeugen, wurde ein Blumendip52 mit Agrobacterium tumefaciens durchgeführt. Die Selektion auf Transformanten in der T0- und T1-Generation wurde mit Kanamycin (Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande) durchgeführt. Um Positionseffekte einer zufälligen T-DNA-Integration nach der Agrobacterium-Transformation zu vermeiden, wurden drei einzeln generierte Linien für weitere Experimente verwendet. Das Vorhandensein der mot2.gus-Konstrukte wurde durch PCR unter Verwendung genomischer DNA getestet.

Histochemische und fluorimetrische GUS-Assays eignen sich gut, um sowohl qualitative als auch quantitative Informationen über die organspezifische Genexpression der Mitglieder der mot2-Familie zu sammeln. Die Tests wurden gemäß Minner-Meinen et al.7 durchgeführt. Transgene A. thaliana mot2:gus-Linien wurden unter Verfügbarkeit von Molybdat für die histochemische Färbung hydroponisch gezüchtet. Pflanzenmaterial wurde mit GUS-Färbelösung53 über eine Vakuumkammer inkubiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Nach der Chlorophyll-Extraktion mit 70 % (v/v) Ethanol erfolgte die Dokumentation mit einem Keyence VHX-Digitalmikroskop (Keyence, Osaka, Japan). Als Kontrolle verwendete WT-Pflanzen zeigten kein Hintergrundsignal in den analysierten Organen (Abb. S3).

Der fluorimetrische Test wurde mit mot2.1:gus-Pflanzen durchgeführt, die hydroponisch unter Molybdatverfügbarkeit und -mangel gezüchtet wurden. Das Pflanzenmaterial wurde bei der Ernte in Wurzeln, junge Blätter, alte Blätter, Spross und Blüte getrennt und die Proteinextraktion wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Proben wurden in eine 96-Well-Platte geladen und mit einer GUS-Reaktionslösung gemischt, die Methylumbelliferylglucuron (MUG; Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande) enthielt, das durch GUS in das fluoreszierende Produkt MU (Methylumbelliferyl; Anregung: 365 nm, Emission: 455 nm) gespalten werden kann ). Die Fluoreszenz wurde mit einem Tristar LB941 Multimode-Lesegerät (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) über einen Zeitraum von 40 Minuten gemessen. Die GUS-Aktivität wurde als Geschwindigkeit des Anstiegs der Fluoreszenzintensität über die Zeit berechnet, normalisiert auf die Menge des Gesamtproteins, gemessen mittels Bradford-Assay unter Verwendung des Roti®Quant-Reagenz (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland). WT-Pflanzen dienten als Negativkontrolle und zeigten in den analysierten Organen kein Fluoreszenzsignal.

Die Blattfläche von A. thaliana-Pflanzen, die hydroponisch wachsen, wurde mit der Easy Leaf Area-Software54 gemessen. Als Referenz diente ein rotes Quadrat mit einer Fläche von 4 cm2. Indem die Anzahl der grünen Pixel ins Verhältnis zur bekannten Anzahl roter Pixel gesetzt wurde, konnte die Blattfläche auf nicht-invasive und schnelle Weise bestimmt werden. 60 Tage lang wurden alle zwei Tage drei Bilder mit einer Panasonic Lumix DMC-GX80 und einem Kameraobjektiv Panasonic H-FS 1442 A (Panasonic, Kadoma, Japan) aufgenommen. Darüber hinaus wurden die Entwicklungsstadien der Pflanzen alle zwei Tage aufgezeichnet55 und das Gesamtüberleben der Pflanzen analysiert. Nach 60 Tagen wurden die Pflanzen geerntet und das Frischgewicht sowie die Wurzellänge gemessen.

A. thaliana (8 Wochen alt) wurden in 130-ml-Röhrchen gezüchtet, die mit molybdathaltiger basischer Nährlösung gefüllt waren. Nach zwei Wochen wurde das Medium in 50-ml-Duplikaten geerntet und die Blattfläche bestimmt. Molybdatkonzentrationen wurden in modifizierter Weise nach Cardenas und Mortensen56 gemessen. Ein Probenvolumen von 50 ml senkte die Nachweisgrenze des Assays auf 10 nM Molybdat. Die Proben wurden gründlich mit 50 µL Schwefelsäure und 250 µL Testreagenz (2 % (w/v) Natriumhydroxid, 2 g/L 1,2-Dimercapto-4-methylbenzol, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA; gemischt). 16 mL/L Thioglycolsäure, Supelco, Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA) für 1 Minute und geschüttelt für 20 Minuten. Nach Zugabe von 1 ml reinem Isoamylacetat, 2-minütigem Mischen und weiteren 20-minütigem Schütteln wurde die organische Phase aus dem konischen Ende des Röhrchens extrahiert. Die Extinktion wurde in einer lösungsmittelbeständigen Küvette bei 680 nm, ausgeblendet gegen reines Lösungsmittel, gemessen. Zur Bestimmung der Molybdatkonzentration wurde eine Kalibrierungskurve von 0 bis 150 nM Natriummolybdat in basischer Nährlösung gemessen. Die Menge an absorbiertem Molybdat wurde berechnet und mit der Blattfläche normalisiert. WT-Pflanzen und mot1.1-KO-Pflanzen dienten als Positiv- bzw. Negativkontrolle.

Der NR-Enzymaktivitätstest57 wurde gemäß Minner-Meinen et al.7 durchgeführt. Blattmaterial von mot2-KO-Linien, die hydroponisch unter Molybdatverfügbarkeit und -mangel gezüchtet wurden, wurde geerntet und unter Kühlung mit flüssigem Stickstoff homogenisiert. Das Homogenat wurde mit Extraktionspuffer vermischt, gründlich gemischt und zentrifugiert. Die Testreaktion wurde durch Mischen des Extrakts mit Testpuffer gestartet und nach 10, 20 und 30 Minuten durch Zugabe von Zinkacetat gestoppt. Die Menge an gebildetem Nitrit wurde kolorimetrisch nach Reaktion mit Sulfaniamid (SA; Merck, Darmstadt, Deutschland) und N-[Naphthyl-(1)]-ethylendiammoniumchlorid (NED; Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA) gemessen. Die NR-Enzymaktivität wurde in nmol NO2- pro mg Frischgewicht und Stunde berechnet.

Stammlösungen von reduziertem GSH (Duchefa, Harlem, Niederlande) und Natriummolybdat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) wurden in Wasser mit einer Konzentration von 2 mM hergestellt. Die 2 mM GSH-Probe wurde mit Wasser auf eine Konzentration von 1 mM verdünnt. Das Spektrum jeder Probe wurde durch Messung der Extinktion von Licht im UV-Bereich im Bereich von 190 nm bis 350 nm in speziellen UV-Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm mit einem UV/VIS-Spektrophotometer Ultrospec 2100 pro (Amersham Biosciences, Amersham, VEREINIGTES KÖNIGREICH). Anschließend wurde der Hintergrund einer Natriummolybdatlösung mit einer Konzentration von 1 mM durch Blanking vom Spektrum abgezogen. Die GSH- und Molybdatlösung wurden äquimolar zu einer Konzentration von jeweils 1 mM gemischt und das Extinktionsspektrum aufgezeichnet.

Messungen der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) wurden mit Q Exactive Orbitrap (Hochleistungs-Tisch-Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometer; Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland) HRMS mit Elektrospray-Ionenquelle (Massenbereich im negativen Modus: m/z =) durchgeführt 100–1500) und Ultimate3000 UHPLC-System (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland). Die Proben wurden entweder durch Direktinjektion (Flussrate betrug 0,6 ml·min−1) oder durch UHPLC injiziert. Die folgenden UHPLC-Bedingungen wurden verwendet: Eine Accucore C18-Säule (2,1 × 100 mm, 2,6 μm, Thermo Fisher, Bremen, Deutschland) wurde mit Gradientenelution wie folgt verwendet: MeCN (0,1 % (v/v) HCOOH)/H2O (0,1 % (v/v) HCOOH) zunächst bei 5:95, erreicht 2:98 über 7 Minuten und hält dann 2:98 für 3 Minuten aufrecht. Die Flussrate betrug 0,2 ml·min−1 und das Injektionsvolumen betrug 3 µL. Isotopenangereichertes Molybdän (Anreicherung > 98 %) wurde von Eurisotop (Saint-Aubin Cedex, Frankreich) bezogen. Das Molybdänoxid 98MoO3 wurde in Natriumhydroxidlösung gelöst, um eine Natriummolybdatlösung aufrechtzuerhalten. Anschließend wurde die vorbereitete Isotopenlösung mit entionisiertem Wasser verdünnt, um eine Stammlösung mit 10−2 mol L−1 Molybdat zu erhalten.

Es wurden drei separate Stammlösungen (jeweils 1 ml) mit Na2MoO4, Na298MoO4 und GSH in einer Konzentration von 10-2 mol·L−1 in Wasser hergestellt. Die GSH-Stammlösung (100 μl) wurde vor der MS-Messung mit Wasser (900 μl) verdünnt. Na2MoO4-Stammlösung (100 μl, 1 Äq.) und GSH-Stammlösung (100 μl, 1 Äq.) wurden gemischt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur (~22 °C) gelagert. Vor der MS-Messung wurde die Lösung mit Wasser (1800 μL) verdünnt. Die Na2MoO4-Stammlösung (100 μL) wurde vor der MS-Messung mit Wasser (900 μL) verdünnt. Alle Proben wurden mit HRMS durch Direktinjektion gemessen. Anschließend wurden Lösungen, die sowohl Molybdat als auch GSH enthielten, mit Molverhältnissen von 1:1 bis 1:9 hergestellt. Bei der MS-Messung wurden identische Ergebnisse beibehalten, dh in allen Proben wurde m/z = 433,9556 festgestellt. Zusätzlich wurden die pH-Werte der Lösungen auf 3, 5, 6, 7 und 9 eingestellt und per HRMS gemessen. In allen Fällen wurde das gleiche Ion mit m/z = 433,9556 beobachtet.

Die Protein-Protein-Wechselwirkung wurde mithilfe eines bimolekularen Fluoreszenzkomplementationsassays43,47 nach Minner-Meinen et al.7 analysiert. Um vergleichbare Ergebnisse zu ermöglichen, wurde die untere Epidermis von 5–10 Blattscheiben von 2–3 N. benthamiana-Pflanzen mit identischen cLSM-Einstellungen analysiert. Der Interaktionsansatz umfasste MOT2-VYNE- und Cnx1-SCYCE-Fusionskonstrukte, die in einer Blatthälfte exprimiert wurden. Die Negativkontrolle bestand aus AtPIP2A-VYNE und Cnx1-SCYCE, die in der anderen Blatthälfte exprimiert wurden. Es wurde eine Häufigkeitskontrolle durchgeführt, bei der Cnx1-SCYCE mit der C-terminalen Hälfte der an SCYCE (CLuc-SCYCE) fusionierten zytosolischen Luciferase (Luc) ausgetauscht wurde, um die Abschätzung unterschiedlicher Konzentrationsniveaus des negativen Kontrollproteins in Korrelation mit der Wechselwirkung zu ermöglichen Annäherung an das Gegenstück und daraus resultierende zufällige Fluoreszenzsignale43.

Lokalisierungs-, Topologie- und BiFC-Studien wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (cLSM) LSM 510 Meta von Zeiss (Göttingen, Deutschland)7,46 durchgeführt. Der cLSM-510META Scankopf war an Axiovert 200 M angeschlossen. Alle Objekte wurden entweder mit einem Plan-Neofluar 10x/0,3 oder einem C-Apochromat 40x/1,2 Wasserimmersionsobjektiv analysiert. Die Anregung erfolgte sowohl mit einem Argonlaser (488-nm-Linie für alle VENUS-Ansätze sowie Chlorophyll-Autofluoreszenz) als auch mit einem Helium-Neon-Laser (543-nm-Linie für eqFP611). Die primäre Strahlteilung wurde durch UV/488/543/633-Spiegel erreicht. Sekundäre Strahlteiler arbeiteten bei 545 nm. Filtersätze zur Detektion von Fluoreszenz wurden wie folgt verwendet: BP 505–530 nm für alle Split-GFP- (Emmax: 510–515 nm) und VENUS- (Emmax: 525 nm) Ansätze; BP 560–615 für eqFP611 (Emmax: 611 nm); LP 650 nm für Chlorophyll-Autofluoreszenz. Der Lambda-Modus wurde verwendet, um die spektrale Signatur aller Fluorophore zu untersuchen. Alle Bilder wurden mit der ZEISS Mikroskopsoftware ZEN 2009 aufgenommen.

Der Split-Luc-Assay zur Analyse der Protein-Protein-Wechselwirkung wurde durch Flotation Leaf Luciferase Complementation Imaging (FLuCI) nach Kaufholdt et al.45 durchgeführt. Der Interaktionsansatz bestand aus Blättern, die MOT2.1-CLuc und entweder Cnx1-NLuc, Cnx1E-NLuc oder Cnx1G-NLuc gemeinsam exprimierten. Die Negativkontrolle ersetzte entweder MOT2.1-CLuc durch AtPIP2A-CLUc oder Cnx1-Konstrukte durch NSP3-NLuc. Die Häufigkeitskontrolle zur Darstellung von Signalen, die aus zufälliger Interaktion stammen, bestand aus SCYCE-NLuc und ersetzte Cnx1-Konstrukte. Interaktionsansatz und Negativkontrolle bzw. Abundanzkontrolle wurden jeweils in eine Blatthälfte infiltriert. Nach 2–7 Tagen Transformation wurden 6 Blattscheiben (12 mm Durchmesser) pro Blatthälfte von 4 Blättern von jeweils 4 Pflanzen mit Luciferinlösung (10 mM MES pH 5,6, 10 mM MgCl2, 0,5 % (v/v) DMSO) infiltriert , 0,1 mM Luciferin). Die Lumineszenz wurde als RLU mit einem Tristar LB941 Multimode-Lesegerät (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) bei 560 nm für 20 Minuten gemessen. Der Split-Luc-Faktor für den Interaktionsansatz wurde berechnet, indem der Mittelwert der Interaktionsansätze mit den Negativkontrollen der anderen Blatthälfte dividiert wurde. Die Split-Luc-Faktoren zur Abundanzkontrolle wurden analog berechnet. Eine Interaktion findet statt, wenn der Split-Luc-Faktor des Interaktionsansatzes höher ist als der Split-Luc-Faktor der Abundanzkontrolle.

Alle Experimente wurden mit mehreren unabhängigen Proben durchgeführt, wie in Materialien und Methoden und den Legenden der Abbildungen beschrieben. Experimente zu Lokalisierung, Termini-Topologie, BiFC, Split-Luc und GUS-Färbung wurden mehrfach durchgeführt und hatten ähnliche Ergebnisse wie die hier berichteten. Die Wachstumskinetik von Saccharomyces und Pflanzen wird mindestens dreimal wiederholt. Mittelwerte unabhängiger Experimente werden aufgetragen und Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Wie in jeder Abbildungs-/Tabellenlegende angegeben, wurde der ungepaarte T-Test zum Testen der Signifikanz verwendet, Zwei-Wege-ANOVA-Analysen und Sidak-Post-hoc-Tests für Mehrfachvergleiche wurden zur Analyse quantitativer Daten verwendet. Es wurden keine Daten aus den gemeldeten Ergebnissen ausgeschlossen und alle biologischen Replikate wurden für statistische Analysen verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten numerischen Daten sind in den Zusatzdaten 1 zu finden und auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Mattes Hintmann und der Arbeitsgruppe von Rebekka Biedendieck von der BRICS (TU Braunschweig, Deutschland) für die Hilfe beim BioLector® und der Versorgung mit Blumentellern. Wir möchten uns für die Hilfe von Prof. Hans Thordal-Christensen (Universität Kopenhagen, Dänemark) bei der Bereitstellung von Split-10 + 1-GFP-Vektoren bedanken. Arabidopsis-T-DNA-KO-Linien wurden freundlicherweise vom Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC, Nottingham, UK) zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus danken wir Prof. Dr. Erwin Grill für die Hilfe zum Thema Schwermetalle und Glutathion. Wir danken auch der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Christian Hertweck für die großartige Hilfe bei massenspektrometrischen Analysen und dafür, dass sie ihre Einrichtung mit uns zur Verfügung gestellt hat. Wir danken Nele Fiene, Moritz Friesch, Benedikt Gierling, Linda Hage, Melanie Heidecke, Jannik Heiligenstadt, Rena Hinrichs, Saskia Kell, Eike Kreitz, Jan-Hendrik Lenzen, Samuel Meckoni, Lena Meißner, Paul Meyfarth, Merve Saudhof, Fynn Schilling, Ina Schmidt, Alexa Schubert, Nico Sprotte, Luca Steinbacher, Claudia Strauch, Kaja Tünnermann, Hanna Willenbockel, Jess Arnold Siani Wouachi und Chris Zaydowicz für ihre Hilfe, ihr hohes Engagement und ihre tolle technische Arbeit in unserem Labor. Unser besonderer Dank gilt unseren Technikerinnen Kristin Eckhoff und Tanja Linke. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Förderung GRK2223/1) an RH und RRM finanziell unterstützt

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

These authors contributed equally: Jan-Niklas Weber, Rieke Minner-Meinen

Institute of Plant Biology, Technische Universität Braunschweig, Humboldtstrasse 1, D-38106, Braunschweig, Germany

Jan-Niklas Weber, Rieke Minner-Meinen, Maria Behnecke, Thomas W. Hercher, Lena van den Hout, Lars Knüppel, Simon Sivov, Jutta Schulze, Ralf-R. Mendel, Robert Hänsch & David Kaufholdt

Institute of Microbiology and Braunschweig Integrated Centre of Systems Biology, Technische Universität Braunschweig, Rebenring 56, D-38106, Braunschweig, Germany

Rebecca Biedendieck

Abteilung Biomolekulare Chemie, Leibniz-Institut für Naturforschung und Infektionsbiologie (HKI), Beutenbergstraße 11a, Fakultät für Biowissenschaften, Friedrich-Schiller-Universität Jena, D-07743, Jena, Deutschland

Veit G. Hänsch & Christian Hertweck

Zentrum für Molekulare Ökophysiologie (CMEP), College of Resources and Environment, Southwest University, Tiansheng Road No. 2, 400715, Chongqing, Beibei District, VR China

Robert Hänsch

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JNW, RMM, RH und DK planten und gestalteten das Projekt. RH und RRM haben Finanzmittel eingeworben. RMM, MB und JNW wurden in silico-Analysen durchgeführt. TWH, RRM, DK und JNW erzeugten Hefestämme. SS, JNW, DK, RH und RB führten Hefewachstumstests durch und diskutierten die Ergebnisse. RMM hat Vektoren für Lokalisierung, Topologie und BiFC entworfen und generiert. JS führte die Isolierung und Transformation von Protoplasten durch. RMM, MB und JNW führten Lokalisierungsstudien durch. RMM führte Topologiestudien durch. RMM und JNW generierten mot2:gus-Anlagenlinien. Lv.dH führte histochemische GUS-Assays durch. JNW führte fluorimetrische GUS-Assays durch. Lv.dH und JNW kümmerten sich um das hydroponische Wachstum und die Phänotypanalyse. JNW führte Tests zur Molybdataufnahme durch. Lv.dH führte NR-Assays durch. RMM, LK und DK führten BiFC-Analysen durch. JNW führte eine UV-Spektrenanalyse von GSH-Molybdat-Komplexen durch. CH und VH führten MS-Experimente durch. Alle Autoren analysierten und diskutierten die Ergebnisse. JNW und DK waren hauptsächlich an der Ausarbeitung des Manuskripts beteiligt. JNW, VH, DK, Lv.dH, LK und RRM erstellten Abbildungen und Tabellen. JS, RH und RRM haben das Manuskript kritisch gelesen und den Text verbessert; Alle Autoren haben es fertiggestellt. JNW, DK und RH koordinierten die Arbeit. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version dieses Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Robert Hänsch.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: David Favero und Manuel Breuer. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Weber, JN., Minner-Meinen, R., Behnecke, M. et al. Moonlighting Arabidopsis Molybdattransporter-2-Familie und GSH-Komplexbildung erleichtern die Molybdänhomöostase. Commun Biol 6, 801 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05161-x

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Eingegangen: 4. April 2023

Angenommen: 21. Juli 2023

Veröffentlicht: 02. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05161-x

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